产品目录

异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate），缩写FITC，是生物学应用最广泛的一种绿色荧光素衍生物，其异硫氰酸基团能与蛋白上的氨基末端和首胺反应，从而将荧光素标记到蛋白上，包括抗体和凝集素。FITC的生物应用包括蛋白的荧光标记，蛋白的荧光示踪，以及荧光抗体的病原体快速鉴定技术。FITC的最大吸收波长为495nm，呈黄-橙色；最大发射波长为525nm，呈黄-绿色。

FITC有两种异构体，即异构体I和异构体II，前者的异硫氰酸基团连接在苯环的C4位置，后者的异硫氰酸基团连接在苯环的C5位置，两种异构体在光谱上如波长或强度上难以区分。然而，异构体I比较容易分离和纯化，因此成本比较低，这也是为什么异构体I更普遍用于标记用的原因。FITC的两种异构体混合物适合大部分实验。

CAS号	3326-32-7
同义名	Fluorescein isothiocyanate isomer I;Fluorescein 5-isothiocyanate;
分子式	C21H11NO5S
分子量	389.38g/mol
外观	橙色粉末
纯度	≥95%（HPLC）
光谱特性	Ex/Em：492/518nm
溶解性	溶于丙酮（1mg/mL），DMSO（5mg/mL），微溶于水（＜0.1mg/mL）
结构式

• FITC标记蛋白
  
  • 制备溶于0.1M碳酸钠缓冲液（pH9.0）的待标记蛋白溶液，浓度≥2mg/mL。
    
    • 勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0～5℃超过1周，因pH值会发生变化，建议现配现用。
      
    • 待标记蛋白必须是未被污染蛋白，且蛋白溶液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如Tris、甘氨酸，因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在4℃于PBS，pH7.4透析过夜；透析过程中如果pH值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。
  • 溶解FITC于无水DMSO配制成1mg/mL的溶液。
    
    • 建议于每次标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光保存。
  • 对于1mL蛋白溶液加入50μlFITC溶液，可按照每次5μL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；
    
  • 待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8h；
    
  • 加入NH4Cl使其终浓度至50mM，4℃终止反应2h；
    
  • 加入二甲苯青至浓度0.1%，甘油至浓度5%；
    
  • 通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC，分离范围在20000～50000（球蛋白例如抗体）。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。此时，可以形成两条带：
    
    • 快速移动带，也就是FITC-蛋白标记物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；
      
    • 慢速移动带，也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。
  • 于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1mg/mL），可加入1%BSA作为一种蛋白稳定剂。
    
  • 标记物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495nm和280nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。
• 荧光素/蛋白摩尔比（F/P）的测定
  F/P摩尔比即蛋白荧光标记物中FITC与蛋白质的摩尔比。为了计算该值，首先需测定该标记物在280nm和495nm的吸光值：将已标记蛋白样品置于石英比色皿中，测得A280和A495，注意A280的值需在0.2～1.4之间，如在该范围外，需调整相应标记样品浓度。